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Datos del producto:
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| Nombre de productos: | qPCR | Temperatura de almacenamiento: | – °C 20 |
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| Robusto y activo para la síntesis del cDNA: | hasta 55°C. | Uso: | Polimerización en cadena |
| Volumen: | 1ml | Transcripción reversa: | gama de temperaturas (42-60°C) |
| Alta luz: | Múltiplex universal QPCR de TaqMan,Reactivo bioquímico del múltiplex QPCR de TaqMan,múltiplex QPCR de 1ml TaqMan |
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Mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex
Principios de diseño de la cartilla:
1. La longitud del producto de la amplificación se recomienda para estar entre el punto de ebullición 80-300;
2. Longitud de la cartilla: 18-25 punto de ebullición;
3. El contenido de la base G+C en cartillas debe estar entre 40%-60%;
4. La diferencia del valor de TM entre las cartillas delanteras y las cartillas reversas es menos que 2℃, y el valor de TM entre 58-62℃ es el mejor;
5. Aleatoriedad de la distribución baja;
6. Las cartillas no deben contener secuencias uno mismo-complementarias, si no formarán una estructura secundaria de la horquilla;
7. Debe haber no más que 4 complementarios o las bases homólogas entre dos cartillas, si no el dimero de la cartilla será formado, especialmente coincidencia complementaria en el 3' extremo;
8. El 3' base terminal de la cartilla se sugiere para ser G o C;
9. No se encontró ningunos otros productos no específicos en resultados de la comparación de NCBI.
Introducción de mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex:
Este producto es una solución de la mezcla preparada de antemano 2x para el qPCR usando método quimérico de la fluorescencia del verde I de GSK. El componente de la base, polimerasa de DNA de Taq, es una polimerasa de DNA calor-activada bloqueada por el método del anticuerpo, que puede inhibir con eficacia la amplificación no específica bajo condiciones de la baja temperatura. Mientras tanto, combinado con el almacenador intermediario de la reacción optimizó para el qPCR, la polimerasa de DNA de Taq es muy conveniente para la alta reacción del qPCR de la especificidad y de la sensibilidad. Una buena curva estándar se puede obtener en un área cuantitativa amplia, que es exacta, reproductiva y confiable para el análisis cuantitativo de los genes de la blanco. Al mismo tiempo, este producto contiene un tinte pasivo especial de la referencia de ROX que sea conveniente para el uso en todos los instrumentos del qPCR, y no hay necesidad de ajustar la concentración de ROX en diversos instrumentos. El tinte azul se añade en la mezcla preparada de antemano, que tiene el efecto del trazalíneas de añadir muestras, y el diluyente amarillo de la plantilla se proporciona al mismo tiempo. Cuando la plantilla se diluye con diluyente amarillo de la plantilla y añadió en la mezcla preparada de antemano azul de la reacción, los cambios del color del azul al verde, que puede desempeñar un papel del trazalíneas en la preparación del proceso del sistema de reacción y prevenir salida o el misaddition. Los espectros de los tintes azules y amarillos no coinciden con los tintes del qPCR y no afectan a los resultados de la reacción.
Protocolo/procedimientos del análisis sobre la mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex:
1. Dilución (opcional) de la plantilla:
Este equipo proporciona un almacenador intermediario AMARILLO del dilución de la plantilla 40x, un dilución amarillo diluido 40 dobleces de la plantilla que se pueda utilizar para determinar exactamente si la plantilla ha sido añadida al líquido de la reacción del qPCR cambiando el color del líquido. Tomar el sistema de reacción del qPCR 20ul como un ejemplo, según la cantidad de la plantilla del dilución añadió en la solución de la reacción del qPCR 20ul, el método correspondiente del dilución de la plantilla original se puede referir la tabla siguiente (que lleva la plantilla original diluida 100ul como un ejemplo):
| Añada la plantilla diluida a la solución de la reacción del qPCR 20ul (la UL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Añada el almacenador intermediario del dilución de la plantilla del AMARILLO 40x al sistema del dilución de la plantilla 100ul (la UL) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8,4 | 7,2 | 6,3 |
| Añada el sistema del dilución de la plantilla 100ul a la plantilla primaria (la UL) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| volumen de añadir la nucleasa - agua libre (UL) | 50-x | 75-x | 83.3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Ejemplo:
2ul diluyó la plantilla se debe añadir al sistema de reacción del qPCR 20ul.
Tomando el sistema del dilución de la plantilla 100ul como un ejemplo, cuando el volumen original de la plantilla es 20ul, se añade el almacenador intermediario amarillo del dilución de la plantilla de 25ul 40x, y entonces el agua Nucleasa-libre 55ul se añade al volumen total de 100ul.
El ALMACENADOR INTERMEDIARIO AMARILLO del DILUCIÓN de la PLANTILLA 40x ahora es 10x. Añada 2ul de la plantilla diluida en un almacenador intermediario del dilución del dilución 20ul, y el almacenador intermediario final del dilución de la plantilla del AMARILLO 40× es 1x. En conclusión, el almacenador intermediario amarillo del dilución de la plantilla debe ser 1x en el sistema final del qPCR.
Información de producto de la mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex:
| Nombre de producto | Identificación del producto | Modelo |
| Mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 ml | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 ml |
Condiciones del almacenamiento y de dirección con la mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex:
Transporte mojado del bolso de hielo; Almacenado en la temperatura de -20℃, válida por 12 meses.
Nota: Si la plantilla no necesita ser diluida, o si el diluyente de la plantilla de G3362-2 no se utiliza, usted puede ignorar este paso.
2. procedimiento de la reacción de la polimerización en cadena (puede ser ajustado según los instrumentos):
a: Si la especificidad de la amplificación necesita ser mejorada, la temperatura del procedimiento de dos etapas o del recocido puede ser utilizada; Para mejorar la eficacia de la amplificación, un procedimiento del tres-paso o un rato de la extensión puede ser utilizado.
Nota:
1. Lleve por favor los guantes disponibles durante la operación para evitar la contaminación de la ARNasa.
2. Los productos reversos de la transcripción se pueden almacenar en -20℃ por poco tiempo. Si el almacenamiento de larga duración es necesario, se recomienda para almacenarlos en -80℃ después de embalar para evitar ciclos hielo-deshielo repetidos.
3. Si la plantilla está de origen eucariótico, se recomienda para seleccionar (despegue) la cartilla oliga 18 y la empareja con el 3' polivinílico una cola del mRNA eucariótico para obtener la producción más alta de cDNA integral.
4. Para la transcripción reversa del ARN procariótico, la cartilla o Gene Specific Primer al azar de Hexamer debe ser utilizada.
5. La cartilla al azar de Hexamer tiene aplicabilidad amplia y es conveniente para el mRNA, el rRNA, el tRNA, el pequeño ARN y las plantillas del lncRNA.
6. Si la transcripción reversa es seguida por análisis del qPCR, (despegue) la cartilla oliga 18 y la cartilla al azar de Hexamer se pueden mezclar para hacer eficacia de la síntesis del cDNA en todas las regiones de mRNA lo mismo, que ayuda a mejorar la autenticidad y la repetibilidad de resultados cuantitativos.
7. Si las cartillas subsiguientes del qPCR se diseñan a través de exones, el paso del retiro del genoma puede ser omitido.
Problemas comunes y soluciones:
| Descripción de problema | Razones posibles | Soluciones |
| En el final de la reacción, ninguna curva de la amplificación apareció o el valor del CT apareció demasiado tarde | La concentración de la plantilla es demasiado baja | Repita el experimento para reducir el múltiplo del dilución de la plantilla, y el comienzo de la concentración más alta cuando la concentración de la muestra es desconocida |
| Degradación de la plantilla | La plantilla fue preparada otra vez y el experimento fue repetido | |
| Hay inhibidores de la polimerización en cadena en el sistema | Generalmente, la plantilla se lleva adentro, el ratio del dilución de la plantilla se aumenta o la plantilla con pureza elevada reprepared y se repite | |
| Las cartillas pueden degradar | Las cartillas que no se han utilizado durante mucho tiempo se deben primero probar para la integridad por electroforesis de la PÁGINA para eliminar la posibilidad de la degradación | |
| Eficacia baja de la amplificación | el ncrease la concentración de la cartilla, intenta un procedimiento de la amplificación del tres-paso, o reajusta la cartilla | |
| El producto de la amplificación es demasiado largo | La longitud del producto de la amplificación fue controlada en el rango del punto de ebullición 80-300 | |
| El control en blanco muestra la señal | Contaminación del sistema de reacción | En primer lugar, el agua del control en blanco debe ser substituida. Si todavía ocurre la misma situación, las cartillas, los aspiradores y los tubos de la polimerización en cadena deben ser substituidos o una nueva mezcla principal debe ser comenzada. El sistema de reacción se prepara en una tabla limpia estupenda para reducir la contaminación del aerosol |
| La amplificación no específica tal como dimeros de la cartilla aparece |
Generalmente, es normal que los productos de la amplificación aparezcan en control en blanco después de 35 ciclos, que se deben analizar con la curva de fusión. La cartilla del reajuste, ajusta la concentración de la cartilla u optimizar procedimiento de la reacción de la polimerización en cadena |
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| La curva de fusión tiene picos múltiples | El diseño de la cartilla es pobre | La nueva cartilla fue reajustada según los principios de diseño de la cartilla |
| La concentración de la cartilla es demasiado alta | Reduzca la concentración de la cartilla apropiadamente | |
| Hay contaminación genomic en plantilla del cDNA | La solución extraída del ARN se digiere usando las enzimas de la DNA, tales como DSDNase, para quitar la contaminación genomic, o para diseñar las cartillas del transintron | |
| Reproductibilidad pobre de experimentos | El error de añadir la muestra es grande |
El uso de la pipeta exacta, con la pipeta exacta de la cabeza de alta calidad de la succión; Alta plantilla del dilución, añadiendo la plantilla de gran capacidad para reducir error de muestreo; El volumen de la reacción de qPCR fue agrandado |
| La concentración de la plantilla es demasiado baja | Repita el experimento para reducir los tiempos del dilución de la plantilla | |
| Desviación de la temperatura en las ubicaciones diferentes del instrumento del qPCR | Calibre el instrumento del qPCR regularmente | |
| La curva de la amplificación no es lisa | La señal de la fluorescencia es demasiado débil, producido después de la corrección del sistema |
Asegúrese de que los tintes premezclados en la mezcla principal no estén degradados; Substituya la señal fluorescente de recoger mejor materiales consumibles del qPCR |
| Roturas o resbalones de la curva de la amplificación | La concentración de la plantilla era más alta y el valor de la punto final de la línea de fondo era mayor que el valor del CT | La punto final de la línea de fondo (valor -3 del Ct) fue reducida y los datos fue reanalizada |
| Las curvas de la amplificación de Wells individual cayeron repentinamente agudamente | Hay burbujas en el tubo de la reacción |
Asegúrese de que la MEZCLA esté disuelta totalmente, y no remoline y no oscile uniformemente; Después de que se añada la muestra, las burbujas son quitadas por la centrifugación con el elástico ligero. La época de la pre-desnaturalización fue prolongada al minuto 10 de quitar las burbujas |
Si usted necesita más información sobre la mezcla principal de TaqMan del qPCR universal del múltiplex, por favor sepamos en línea, gracias.
Persona de Contacto: Ms. Kris Zhang
Teléfono: 0086-0769-85914911
